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技術資訊
Technical Information王繼鳳1 李芙燕1 陳耀星1 3 王子旭1 咼于明2
(1. 中國農業大學動物醫學院,北京100193 ; 2. 中國農業大學動物科技學院,北京100193)
摘 要: 本試驗通過日糧中添加丁酸鈉研究其對肉雞小腸黏膜免疫相關細胞的影響。將32 只1 日齡健康AA 肉雞隨機分為4 個處理組:A 組(對照組:基礎日糧) 、B 組(丁酸鈉組:基礎日糧+ 500 mg/ kg 丁酸鈉) 、C 組(丁酸鈉+ 芽孢桿菌組:基礎日糧+ 100 mg/ kg 丁酸鈉+ 200 mg/ kg 芽孢桿菌) 和D 組(丁酸鈉+ 酶制劑組:基礎日糧+ 100 mg/ kg丁酸鈉+ 500 mg/ kg 酶制劑) 。試驗7 周后,采用組織學技術研究肉雞小腸黏膜免疫相關細胞的分布變化。結果顯示: (1) 與對照組比較,小腸肥大細胞、上皮內淋巴細胞及杯狀細胞的形態無明顯變化,肥大細胞多存在于腸腺周圍和腸絨毛固有層; (2) 各試驗組的小腸肥大細胞、上皮內淋巴細胞及杯狀細胞數均顯著高于對照組( P < 0.05) ; (3)各試驗組和對照組小腸肥大細胞和上皮內淋巴細胞數均從前向后逐漸減少,十二指腸的肥大細胞最多,空腸的次之,回腸的較少;杯狀細胞數則與之相反。由此可知,3 種添加劑可不同程度地改善肉雞小腸黏膜結構,且將丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合飼喂,效果在一定程度上好于單獨飼喂丁酸鈉。
關鍵詞: 丁酸鈉;黏膜免疫相關細胞;小腸;肉雞
短鏈脂肪酸(s hort chai n f at t y acid ,SCFA) 是由大腸內厭氧菌通過發酵可溶性纖維產生的碳鏈為1～6 的有機酸。在短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸和丁酸對人體代謝有重要作用。其中丁酸有水、脂兩親性,偏重于親脂。在p H 4～6 時不易被分解,所以部分可以避過酸性環境的小腸, 直接進入盲腸和結腸。由于丁酸具有游離性和揮發性的特點,所以在生產中一般將其制成相對穩定的鈉鹽。在20 世紀80 年代初期國外學者就已經觀察到短鏈脂肪酸鈉鹽影響瘤胃營養代謝及其消化能力。丁酸鈉作為一種新型飼料添加劑, 對動物的生長有一定的促進作用,同時還可以為結腸提供能量物質。另外在畜禽日糧中添加酸化劑丁酸鈉也可以促進動物生長、提高飼料轉化率、改善動物腸道內微生物區系以及調整動物腸道菌群的生態平衡,提高其機體免疫力。但對于丁酸鈉作為一種新型飼料添加劑的研究主要集中于對動物生長和生產的影響, 而對小腸形態結構影響的研究比較薄弱。為此,本試驗擬通過研究丁酸鈉及其與其他類飼料添加劑配伍后對肉雞小腸形態結構的影響, 為科學使用這種飼料添加劑提供形態學依據。
1、材料與方法
1. 1 試驗動物的分組與飼養
將32 只1 日齡健康AA 肉雞隨機分成4 個處理組,每組8 只:A 組(對照組:基礎日糧) 、B 組(丁酸鈉組:基礎日糧+ 500 mg/ kg 丁酸鈉) 、C 組(丁酸鈉+ 芽孢桿菌組:基礎日糧+ 100 mg/ kg 丁酸鈉+ 200 mg/ kg芽孢桿菌) 和D 組(丁酸鈉+ 酶制劑組:基礎日糧+100 mg/ kg 丁酸鈉+ 500 mg/ kg 酶制劑) 。開放式雞舍單籠飼養,各組其他飼養管理方法完全一致,即按北京愛拔益加家禽育種有限公司提供的《肉用仔雞飼養管理手冊》進行飼養管理,飼養期為7 周。
1. 2 取材
將肉雞放血處死, 剖開腹腔, 迅速取出十二指腸、空腸和回腸各5 cm 左右,用新配制的生理鹽水洗干凈,放入4 %多聚甲醛磷酸緩沖液(011 mol/ L ,p H 7.4) 中固定48 h 。
1. 3 染色與數據處理
1. 3. 1 甲苯胺蘭染色
石蠟包埋,連續橫斷切片, 厚6 μm 。在染色液(0.8 %甲苯胺蘭,0.6 %高錳酸鉀,蒸餾水煮沸配制)中浸染約30 s , 蒸餾水洗2 次后, 用90 %酒精分色(顯微鏡下控制) ,100 %酒精脫水,二甲苯透明,中性
樹脂封片。光鏡下觀察肥大細胞的形態及其分布,統計各段小腸橫斷面全層肥大細胞的數量。SAS8.2 軟件包(SAS Institute , 2001) 對統計的數據進行單因素方差分析。
1. 3 . 2 HE 染色和PAS 染色
石蠟包埋, 連續橫斷切片, 厚6 μm , 進行常規HE 染色和PAS 染色。光鏡下詳細觀察上皮內淋巴細胞和杯狀細胞的形態及其分布, 在各段小腸每一橫切面中選取5 根柱狀細胞排列整齊的腸絨毛,統計每100 個柱狀細胞中散在分布的上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量。應用SAS 8. 2 軟件包(SAS Institute , 2001) 對數據進行單因素方差分析。
2、結果
2. 1 各處理組小腸肥大細胞、上皮內淋巴細胞和杯狀細胞分布與形態
2. 1 . 1 小腸肥大細胞
由圖1 可知,經甲苯胺藍染色后,肥大細胞呈紫紅色; 形狀多樣,有圓形、橢圓形或梭形,大小不一。胞漿內顆粒豐滿, 部分細胞呈脫顆粒狀。各試驗組肥大細胞的形態未見明顯差異。各試驗組小腸的肥大細胞多存在于腸腺周圍。小腸絨毛也有肥大細胞分布,但多位于固有層中,且按小腸絨毛底部、中部、頂部依次減少。少量肥大細胞分布于肌層和漿膜層,常見于小血管和小淋巴管周圍。
2. 1. 2 上皮內淋巴細胞和杯狀細胞
由圖1 可知,經HE 染色后在光鏡下觀察,可見上皮內淋巴細胞散在分布于腸絨毛上皮細胞之間,多數位于上皮細胞基側膜附近。少量見于上皮核層和頂層。該細胞以小型細胞為主, 胞核大而圓, 深染,胞漿較少。杯狀細胞經PAS 染色后呈紅色, 高腳杯狀,散在分布于上皮細胞間,不同的腸段杯狀細胞的數量也有所不同。
2. 2 小腸肥大細胞、上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量
2. 2 . 1 小腸肥大細胞
由表1 可以看出,各試驗組肥大細胞的數量存在差異,且均高于對照組( P < 0.05) 。在十二指腸,D 組的肥大細胞最多, 其次是C 組, 但2 組間差異不顯著( P > 0.05) ,B 組的肥大細胞數量少于C 組,但多于A 組, 并且3 組之間存在顯著差異( P <0.05) ;空腸D 組的肥大細胞最多,其次分別是C 、B組,D 組與C 、B 組間存在顯著差異( P < 0.05) ,但C和B 組間無顯著性差異( P > 0.05) 。回腸的肥大細胞C 組最多,其次是B 和D 組,而C、B 和D 組之間無顯著性的差異,但C、B 和D 組與對照組間存在顯著性差異( P < 0.05) 。各處理組的肥大細胞數從十二指腸到回腸逐漸減少。
2. 2 . 2 上皮內淋巴細胞
表2 為各處理組小腸上皮內淋巴細胞數量的變化。在十二指腸中C 組的上皮內淋巴細胞數最多,D 組次之, 2 組間無顯著性差異( P > 0.05) ,B 組的上皮內淋巴細胞數量顯著少于D 組( P < 0.05) ,各試驗組的上皮內淋巴細胞數量都顯著多于對照組( P < 0.05) ;空腸的上皮內淋巴細胞數量以D 組最多,其次是C 組, 2 組間存在顯著性差異( P <0.05) ,B 組的上皮內淋巴細胞數量顯著少于C 組( P < 0.05) ,3 個試驗組上皮內淋巴細胞數量顯著多于對照組( P < 0.05) ; 回腸以D 組上皮內淋巴細胞數量最多,其次是B 組, 2 組間無顯著性差異( P >0.05) ,C 組上皮內淋巴細胞數量顯著少于D 組( P < 0.05) , 各試驗組上皮內淋巴細胞數顯著多于對照組( P < 0.05) 。各試驗組的上皮內淋巴細胞數從十二指腸到回腸遞減。
2. 2 . 3 上皮內杯狀細胞
表3 可以看出各處理組對上皮內杯狀細胞數量的影響。在十二指腸中D 組的杯狀細胞數最多,其次是C 組,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) , C 組的杯狀細胞數量顯著多于B 組( P < 0.05) , 各試驗組的杯狀細胞數量都顯著多于對照組( P < 0.05) ;在空腸中D 組的杯狀細胞數最多,B 組次之,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) , C 組的杯狀細胞數顯著少于B 組( P < 0.05) , 3 個試驗組的杯狀細胞數量除C 組外都顯著多于對照組( P < 0.05) ; 回腸的杯狀細胞數量也是以D 組的最多,C 組較少,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) ,B 組的杯狀細胞顯著少于C 組( P < 0.05) ,各試驗組的杯狀細胞都顯著多于對照組( P < 0.05) 。表3 反映出各組小腸上皮內杯狀細胞數量由十二指腸到回腸逐漸增加。
3、討論
3. 1 3 種飼料添加劑對肉雞小腸肥大細胞數量分布的影響
腸道不僅是消化、吸收營養物質的場所,而且具有重要的免疫功能。由于在腸道內多種微生物形成菌叢,而腸道允許這些微生物共存的同時,可以識別侵入的有害微生物以及被黏膜上皮吸收的異己物質,并加以排除,因而腸道黏膜免疫是機體防止感染的第一道防線。腸道黏膜屏障包括機械屏障和免疫學屏障等,主要由腸黏膜吸收上皮細胞和腸道相關淋巴細胞構成。腸黏膜吸收上皮細胞除了具有營養物質消化吸收功能外, 在調節機體天然和獲得性免疫中也具有重要的作用。腸道相關淋巴細胞包括肥大細胞、淋巴細胞、杯狀細胞等,其中肥大細胞是天然免疫的效應細胞之一, 不僅在天然免疫中發揮重要作用,是機體抗感染免疫的第一線細胞,而且能通過所分泌的細胞因子參與獲得性免疫,所以肥大細胞是重要的免疫活性細胞。有報道指出腸道中的肥大細胞對腸道疾病有一定的防御作用, 腸道黏膜上皮首先對入侵的細菌發生反應, 從而激活鄰近的肥大細胞產生放大效應。本試驗在飼料中加入不同的添加劑后,發現不同程度地促進肉雞小腸肥大細胞的數量增加, 而丁酸鈉和酶制劑組肥大細胞的數量增加最多, 作用略強于丁酸鈉和芽孢桿菌組, 但這兩組增加的肥大細胞數量都多于丁酸鈉組, 這說明將丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合使用, 能更好的維護機體的免疫功能,防止機體受到病原菌的侵害,從而有利于機體的生長。試驗結果表明各處理組的肥大細胞從十二指腸到回腸遞減, 有試驗表明在小鼠消化道中空腸的肥大細胞數量也多于回腸的肥大細胞數量,與本研究結果類似。但是, 肥大細胞這種分布特點的生理意義還有待于進一步研究。
3. 2 3 種飼料添加劑對肉雞小腸上皮內淋巴細胞數量分布的影響
腸道相關淋巴組織分為組織性淋巴樣組織及散在于整個腸壁中的淋巴細胞。上皮內淋巴細胞是黏膜免疫系統中最先接觸抗原的免疫活性細胞, 在腸道黏膜中起重要的免疫屏障作用。本試驗的結果表明將丁酸鈉和酶制劑混合加入飼料中會使上皮內淋巴細胞的數量明顯的增多, 而且效果好于丁酸鈉和芽孢桿菌的混合作用, 但是這兩組間在空腸和回腸中的作用有一定的差異, 這可能是因為酶制劑主要在空腸和回腸發揮作用。本研究結果表明各組上皮內淋巴細胞從十二指腸到回腸逐漸減少, 這一分布特點和已有的報道一致 。
3. 3 3 種飼料添加劑對肉雞小腸上皮內杯狀細胞數量分布的影響
在吸收細胞中還夾雜有杯狀細胞, 杯狀細胞的主要功能是分泌黏蛋白,黏蛋白是一種糖蛋白,釋入管腔內成為潤滑性黏液涂布于上皮表面, 對上皮具有保護作用。杯狀細胞分泌的黏蛋白和柱細胞分泌的復合糖蛋白組成了腸道黏膜上皮細胞表面的細胞衣,而且細胞衣的糖蛋白和細胞膜的蛋白質和脂質結合牢固,可捕獲微生物,是潛在致病原的重要物理屏障。在本試驗中發現在飼料中添加丁酸鈉和酶制劑會使上皮內杯狀細胞的數量顯著增多, 而且效果要好于丁酸鈉和芽孢桿菌的混合使用, 但是將丁酸鈉分別與酶制劑和芽孢桿菌混合使用,效果都好于單獨使用丁酸鈉。試驗結果表明各處理組的杯狀細胞由十二指腸到回腸逐漸遞增, 細胞衣增厚,可以更好發揮其潛在的物理屏障, 從而避免機體受到外界病原微生物的侵害。這表明這幾種添加劑提高了機體的免疫能力, 有利于機體的生長。Clausen 等研究表明腸道內丁酸鹽濃度降低是結腸息肉和結腸癌發病率高的原因之一。也有研究表明丁酸鈉可以減緩結腸癌細胞的生長和分化。這些研究說明丁酸鈉對動物免疫水平具有一定的作用, 而本研究中的數據表明在飼料中添加丁酸鈉可以顯著增加肥大細胞、上皮內淋巴細胞和杯狀細胞的數量, 這也說明丁酸鈉可以提高動物的腸黏膜免疫功能, 增強黏膜的屏障功能。有研究表明芽孢桿菌是一種益生素,它能在數量上補充腸道內缺乏的正常微生物,調整、維持體內生態平衡,從而增強動物機體的免疫功能,提高飼料轉化率,達到防病治病,提高畜禽生產性能的目的。酶制劑則含有多種消化酶, 能有效促進各種營養物質的消化和吸收, 減少營養過剩性腹瀉的發生。這與本試驗的結果一致。
4、結論
通過本試驗在飼料中添加500 mg/ kg 的丁酸鈉、200 mg/ kg 芽孢桿菌和500 mg/ kg 酶制劑后, 可增加肉雞小腸肥大細胞、杯狀細胞及上皮內淋巴細胞的數量, 但丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合飼喂, 效果在一定程度上好于單獨飼喂丁酸鈉。
